Năm 20 tuổi, Gillian chuyển đến New York. Cô từng làm phục vụ bàn để kiếm tiền gây dựng sự nghiệp. Cô bắt đầu sự nghiệp với vở kịch của Alan Ayckbourn, Absent Friends tại Manhattan Theatre Club. Năm 1990-1991, cô đã giành được giải "Newcomer" của Theatre World.

Năm 1992, Gillian chuyển đến Los Angeles, và dành một năm để thử vai. Dù từng tuyên bố không bao giờ làm truyền hình, nhưng cô đã thay đổi ý kiến sau khi bị mất việc. Vào năm 1993, Gillian đóng vai khách mời trong Class of '96 của Fox Network.

Cùng với đó, cô được gửi kịch bản thử vai cho bộ phim truyền hình The X-Files ở tuổi 24. Cô quyết định thử vai vì "lần đầu tiên trong một thời gian dài, có kịch bản với hình tượng vai nữ chính mạnh mẽ, độc lập, thông minh". Nhà sản xuất Chris Carter muốn tuyển Gillian, nhưng FOX lại muốn một nữ diễn viên đã tiếp xúc với truyền hình trước đó và hấp dẫn hơn,[9] nhưng Chris đã kiên quyết bảo vệ ý kiến của mình. Cuối cùng, Gillian đã được chọn đóng vai nữ đặc vụ FBI Dana Katherine Scully. Bộ phim gồm 9 phần, kéo dài trong vòng 9 năm, với 202 tập, quay chủ yếu tại Vancouver và LA. Ngoài ra cô còn tham gia 2 bộ phim điện ảnh X-files vào năm 1998 và 2008. Cùng với vai diễn Dana Scully của mình, Gillian đã giành được một giải Emmy, một giải Quả cầu vàng và hai giải Screen Actors Guild dành cho "Nữ diễn viên chính xuất sắc nhất". Trong quá trình làm phim, Gillian đã kết hôn cùng trợ lý chỉ đạo nghệ thuật Clyde Klotz.

Trong thời gian đó, Gillian còn đóng bộ phim The House of Mirth dựa theo tiểu thuyết nổi tiếng cùng tên, và bộ phim tình cảm hài lãng mạn Playing by Heart, lồng tiếng vai Moro cho bộ phim hoạt hình Công chúa Mononoke.

Sau khi The X-Files kết thúc, Gillian có nhiều hoạt động phim ảnh khác nhau, chủ yếu liên quan việc tường thuật phim tài liệu và khoa học. Năm 2005, cô xuất hiện với vai nữ chính Lady Dedlock trong bộ phim truyền hình Bleak house (dựa theo tiểu thuyết cùng tên) và được đề cử giải Golden Satellite, Quả cầu vàng cho vai diễn này.

Năm 2006 và 2007, Gillian xuất hiện trong hai bộ phim Anh: The Last King of Scotland (2006) và Straightheads (2007).

Từ ngày 10 tháng 12 năm 2007 đến ngày 11 tháng 3 năm 2008, Gillian quay phim điện ảnh The X-Files: I Want to Believe. Bộ phim được phát hành vào ngày 25 Tháng 7 năm 2008, DVD phát hành vào ngày 2 tháng 12 năm 2008.

Trong Lawrence Olivier Awards 2010, Gillian Anderson đã được đề cử giải Nữ diễn viên chính xuất sắc nhất với vai diễn Nora năm 2009.

Năm 2011, Gillian đóng vai Giám đốc Tình báo Anh MI7 Pamela (Pegasus) trong bộ phim điện ảnh Johnny English Reborn.